顾恺之字长康，晋陵无锡人。父亲顾悦之，任尚书左丞。顾恺之博学富有才识，曾撰写《筝赋》，赋完成后对人说：“我的赋可比嵇康的琴音，不愿欣赏者必以为它是后辈之作弃之不顾，但深有见识者必因它不同凡响而珍视。”
桓温征召他为大司马参军，极为亲近。桓温去世后，顾恺之拜祭他的墓，赋诗说：“山已崩裂海水枯竭，鱼鸟何处归宿。”有人问道：“你如此借重桓公，痛哭之状可见吗？”答道：“哭声像震雷可使山崩，眼泪如河流倾注大海。”
顾恺之性好诙谐戏谑，人多亲近他。后为殷仲堪参军，也非常被宠爱和亲近。殷仲堪在荆州，顾恺之曾因度假还乡，仲堪特用帆船助行，经破冢，遭大风袭击毁坏了很多东西。他在给仲堪的信中说：“地名叫破冢，的确是破了冢出来的。但行人平安，布帆未损。”返回荆州以后，有人向他问会稽山川的景色，他说：“丛山峻岭竞艳，条条河谷争流。草木非常茂盛，宛如云蒸霞蔚。”桓玄为将时常与恺之在仲堪处，共作了语。恺之先说：“火烧平原没有遗物。”桓玄说：“白布缠根黑旗垂树。”仲堪说：“投鱼深泉放出飞鸟。”接着又作危语。桓玄说：“矛头淘米剑头为炊。”仲堪说：“百岁老人攀登枯枝。”有一参军插言：“盲人骑瞎马面临深池。”殷仲堪一只眼失明，吃惊地说：“这太威逼人了！”因而作罢。顾恺之每当吃甘蔗时，总是从稍至根吃。人怪其所为，他说：“这样可渐入佳境。”
顾恺之更善于绘画，运笔特别微妙，谢安非常重视他的画，认为是自生民以来未有之作。他的人物画画成以后，往往历经数年不点眼睛。有人问是为什么，他答道：“四体的美与丑，本来和画的妙处无关，传神写照，正在眼睛之中。”他曾经爱一邻家女子，但挑逗不愿从。于是将邻女的像画在壁上，用刺针钉其心，邻女即患心痛病。顾恺之向她表述了这个情由，邻女才表示依从，于是暗暗拔去刺针使其病愈。顾恺之特别看重嵇康的四言诗，因而为他的诗作画。他常说：“手挥五弦的动作容易画，目送归鸿的神态就难画了。”每涂画起人形，时人称为绝妙。曾经画裴楷像，面颊上只添了三根毛，观者便觉精神面貌逼真。又给谢鲲画像，人在岩洞旁，他说：“此人当置于丘壑之中。”拟画殷仲堪，因仲堪有眼病，不让画。恺之说：“明府不让画正因为眼睛，如果明点眼珠，飞白擦过，让它如轻云蔽月那样，岂不是很美吗？”仲堪便答应了。顾恺之曾将一盒藏画贴上题字的封条，寄赠桓玄，藏画都是他非常珍惜的作品。桓玄从盒后启开，取了藏画，将盒修好封牢还给他，谎称未开。他见封题一如寄前，只是不见了藏画，只说是画自通神灵，变化出去了，就像人修成仙而升天一样，对此毫无奇怪的表情。
顾恺之夸耀自己言过其实，少年时与人相互标榜各自的美名，故作戏谑嘲笑。又会咏诗，自称得到先贤风韵写作规范。有人请他作洛嫔赋，他说：“为何要作老婢女之声呢！”晋义熙初年(405)，他任散骑常侍，与谢瞻所在官署毗连，夜晚在月下久坐吟诗，谢瞻往往神色飘逸含糊称赞，顾恺之经久自吟不倦。谢安将要入睡，令从人代替自己相陪，恺之竟不察觉，自吟到天明才止。他还迷信一些小法术，认为诚心求之便可得到。桓玄曾拿一柳叶骗他说：“这是蝉隐蔽的叶子，取得了它可自隐其身，人不能见。”顾恺之甚喜，用柳叶自蔽，桓玄即在近恺之处便溺，他便相信桓玄没有看见他。把这柳叶看得珍贵。
早期，顾恺之在桓温府，常说：“恺之体内痴愚聪慧各半，合而言之，正等于平平。”所以世间传说他有三绝，即才绝、画绝、痴绝。享年六十二岁，死于任上，著有文集及《启蒙记》传之于世。